摘要：目的探讨大豆肽（soybean peptide, sp)通过下调notch 1信号通路防治哮喘大鼠气道炎症反应的作用机制。方 法将60只sd雄性大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松（dexamethasone,dex)0.5mg/kg组及大豆肽 600、300 及 150 mg/kg 剂量组。采用卵清蛋白（ovalbumin, ova) + 氨氣化f吕（aluminum hydroxide, al (oh) 3)法复制大 鼠哮喘动物模型，同时给予相应剂量的大豆肽进行干预，每天给药1次，连续7 d。末次给药24 h后收集大鼠肺泡灌洗 ye（broncho - alveolar lavge fluid, balf),进行白细胞分类计数；取大鼠右下叶肺组织常规he染色，观察肺组织病理学 改变及气道重塑变化；采用逆转录pcr和western - blot法检测大鼠肺组织notch 1、jagged 1、hes 1及nf - kb mrna 和蛋白表达水平。结果与哮喘模型组比较，大豆肽600 mg/kg剂量组大鼠balf中的中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸 性粒细胞计数显著降低（p <0.01);大鼠肺组织病理损伤较模型组明显改善，炎性细胞浸润明显减少；大鼠肺组织 notch 1、agged 1、hes 1及nf - kb mrna和蛋白表达水平明显下调（p <0. 05,p <0. 01)。结论大豆肽对哮喘大鼠 炎症反应具有防治作用，其机制与下调notch 1/jagged 1/hes 1/nf-kb信号通路有关。
关键词：大豆肽；哮喘;notch 1;炎症
支气管哮喘（bronchial asthma, ba)简称“哮喘” 是一种常见的呼吸系统炎症性病症，往往伴有巨噬细
作者简介:张玲（1981 -),女，本科，讲师，研究方向：呼吸系统疾病防治 通讯作者：徐松涛，e - mail:375874072@ qq. com 胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞及中性粒细胞 等炎性细胞浸润和气道上皮细胞损伤，出现气道平滑 肌痉挛，表现为喘息、呼吸困难、气急、剧烈咳嗽等哮 喘症状1。notch 1信号通路是调控细胞分化、迁移、 凋亡、增殖、炎症及肿瘤发生等生理病理过程的重要 信号分子12。研究报道，notch 1信号通路激活后可 诱导气道成纤维细胞分化和增殖，促使气管重塑，引
发免疫系统紊乱,诱导炎症反应，从而引发和促进支 气管哮喘的发生发展。大豆肽（soybean peptide, sp)是大豆经过酶解或微生物发酵分离提取得到的多 肽混合物，具有免疫调节、抗氧化、缓解疲劳等作 用。本研究观察了大豆肽对哮喘大鼠的防治作 用，并以notch 1信号通路为研究对象探讨其抗炎平 喘分子机制。
1材料与方法
1.1实验动物sd大鼠（spf级），雄性,w龄，体 重180 ~200 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司， 许可证号：scxk (湘）2011 -0003。将大鼠适应性饲 养5d,每笼4 ~5只,3 ~4d更换1次垫料,调整室 内温度为 22 ±2°c,湿度为 45% ~ 65%, 12 h/12 h 光照周期，常规饮食水。
1.2主要试剂大豆肽，河南省南街村（集团）有限 公司；地塞米松碟酸钠注射液（dexamethasone, dex ) 国药准字h41020055,郑州卓峰制药有限公司；卵清 蛋白（ovalbumin, ova),美国 sigma 公司；兔抗 notch 1、jagged 1、hes 1、nf - kb 及卩-actin 抗体，羊抗兔 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, hrp)标记二 抗、增强型ripa蛋白裂解液、彩色预染蛋白marker (10 ~180 kda)、pvdf 膜及 sds - page 凝胶制备试 剂盒等均购自武汉博士德生物工程有限公司；trizol 总 rna 抽提试剂、easy - load™ pcr master mix (blue, x)、beyort™ ii cdna第yi链合成试剂盒等 由上海碧云天生物技术有限公司南通分公司提供； pcr实验所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 设计合成。
1.3实验动物分组及处理将sd雄性大鼠随机分为6组，每组10只，分别为：正常对照组、哮喘模型 组、地塞米松及大豆肽高、中、低剂量组。正常对照组 于实验第1 d和第7 d腹腔注射生理盐水0. 2 ml,其它 各组于实验第1 d和第7 d腹腔注射致敏ye（ova 5 mg +氯氧化铝200 mg +生理盐水1 ml充分混悬）0. 2 ml。第8 d,将大鼠置于诱咳引喘仪（xr - yls -8a 多功能诱咳引喘仪，上海欣软信息科技有限公司）中， 正常对照组大鼠用生理盐水进行雾化激发，其它组用 1% ova生理盐水溶液进行雾化，1次/d,每次30 min。从雾化第2 d开始,于每次激发前正常对照组和 哮喘模型组灌胃生理盐水，地塞米松组大鼠腹腔注射 地塞米松0. 5 mg/kg,大豆肽组大鼠分别灌胃大豆肽 600、00及150 mg/kg,连续激发和给药7 d。末次激 发24 h后，将大鼠麻醉，快速取下肺组织，收集肺泡灌 洗液,进行白细胞分类计数，然后将肺组织用生理盐 水冲洗干净，取右下叶肺组织用于组织学检测，剩余 组织冻存于-80c超低温冰箱中备用。
1.4大鼠肺组织形态学观察取大鼠右下叶肺组 织，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,经系列浓度乙 醇脱水后进行石蜡包埋、切片及he染色，显微镜下 观察肺组织病理学改变。
1.5 rt - pcr法检测大鼠肺组织notch 1、jagged 1、 hes 1及nf - kb mrna表达水平取大鼠左上叶肺 组织约50 ~60 mg,置入盛有液氮的研钵中充分研磨 至粉末状，加入1. 5 ml trizol充分混匀裂解消化，12 000 rpm 4c离心20 min,吸取上清，根据试剂盒说明 书操作步骤进行rna抽提和逆转录反应。将逆转录 得到的cdna进行pcr扩增实验，各待测基因引物序 列见表1。
1.6 western blot 法检测大鼠肺组织 notch 1、jagged 1、hes1及nf - kb蛋白表达水平取大鼠左下叶肺 组织约80〜100 mg,剪碎置于离心管中，加1.5 ml ripa裂解液于冰上充分匀浆,然后再裂解约30min, 4c 12 000rpm离心15min,取上清移入1.5mlep管 中，进行蛋白定量，并调整浓度一致。将上清样品与 蛋白上样缓冲液等体积混匀后煮沸5min,以25 ^l/
孔上样，进行sds-page电泳，转印至pvdf膜，依 次进行封闭、一抗、二抗孵育、显色及拍照等步骤，以 p - actin 为内参,分析待测蛋白相对表达值。
1.7统计学处理用spss18.0统计软件进行数据 处理,数据以mean 盨d表示，多组间的两两比较采 用单因素方差分析（ one - way anova)和 lsd - t 检 验，检验水准为a =0.05。
2 # 中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数明显增多
(p<0.001);与哮喘模型组比较，大豆肽600、300 2.1大豆肽对哮喘大鼠balf中白细胞分类计数的 mg/kg组大鼠balf中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸 影响与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠balf中 性粒细胞数显著降低（p <0.001)。结果见表2。
组别
浓度（mg/kg)
中性粒细胞（107/l)
淋巴细胞（107/l)
嗜酸性粒细胞（107/l)
正常对照
-
8.04±1.36
19.53?.64
3.53?.45
哮喘模型
-
20.96 ?.53b
45.24 ?.47b
12.09?.69b
地塞米松
0. 5
9.71?.17d
23.72?.55d
4.43?.16ad
大豆肽高剂量
600
11.61?.07c
30.88 ?.89ac
5.61?.40bd
大豆肽中剂量
300
14.11?.47ac
35.98 ?.08bc
7.49?.63bc
大豆肽低剂量
150
18.46?.59b
43.62?.41b
10.49?.80b
f值
23.267
23.032
49.249
p值
<0.001
<0.001
<0.001
表2大豆肽对哮喘大鼠balf中白细胞分类计数的影响（x 眘，= 10)
注：与正常对照组比较,p <0.05, bp <0.01;与哮喘模型组比较,p <0.05, dp <0.01
2.2大豆肽对哮喘大鼠肺组织病理学变化的影响 增厚，管腔变窄，部分有胶原沉积；大豆肽600、00
正常对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡无萎缩塌陷， mg/kg组大鼠肺组织病理损伤较模型组明显改善，炎
气道内壁未见增厚，偶见炎性细胞浸润；哮喘模型组 性细胞浸润减少，肺泡结构较为完整，但仍不能恢复
&:正常对照组沁：哮喘模型组;〇:地塞米松组;3:大豆肽600瓜呂八呂;6:大豆肽300瓜呂八呂;£:大豆肽150瓜呂八呂大鼠肺组织可见多量、散在的炎性细胞浸润，气道壁 至正常。
图1大豆肽对哮喘大鼠肺组织病理形态的影响（x200)
2.3大豆肽对哮喘大鼠肺组织notch 1、jagged 1、 hes 1及nf - kb mrna表达水平的影响与正常对 照组比较，哮喘模型组大鼠肺组织notch 1、jagged 1、 hes 1及nf - kb mrna表达水平明显上调（p < 0.001);与哮喘模型组比较，大豆肽600 mg/kg组大
鼠肺组织 notch 1、agged 1、hes 1 及 nf - kb mrna 表达水平显者下调（p <0. 001)。结果见图2、表3。 2.4大豆肽对哮喘大鼠肺组织notch 1、jagged 1、 hes 1及nf - kb蛋白表达水平的影响与正常对照 组比较，哮喘模型组大鼠肺组织notch 1、jagged 1、
hes 1及nf - kb蛋白表达水平明显上调（p < 鼠肺组织notch 1、jagged 1、hes 1及nf - kb蛋白表
表3大豆肽对哮喘大鼠肺组织notch 1、jagged 1、hes 1及nf - kb mrna表达水平的影响（x 土 s, n = 10)0.001);与哮喘模型组比较，大豆肽600 mg/kg组大 达水平显著下调（p <0.001)。结果见图3、表4。
组别
浓度（mg/kg)
notch 1/ p - actin
jagged 1/ p - actin
hes 1/ p - actin
nf - kb / p - actin
正常对照
-
0.167?.029
0.249 ?.035
0.210?.039
0.116?.020
哮喘模型
-
0.458 ?.037b
0.669 ?.050b
0.435 ?.060b
0.805 ?.037b
大豆肽高剂量
600
0.317?.042ac
0.313?.039d
0.291?.018ac
0.564 ?.044bd
f值
47. 721
88.186
21.273
293.292
p值
<0.001
<0.001
0. 002
<0.001
注：与正常对照组比较,p <0.05, bp <0.01;与哮喘模型组比较,p <0.05, dp <0.01
表4大豆肽对哮喘大鼠肺组织notch 1、jagged 1、hes 1及nf- kb蛋白表达水平的影响（x 土 s, n = 10)
组别
浓度（mg/kg)
notch 1 /p - actin
jagged 1 /p - actin
hes 1 /p - actin
nf - kb / p - actin
正常对照
-
0.189 ?.040
0. 365 ?0. 043
0. 264 ?0. 027
0.258 ?.056
哮喘模型
-
0. 775 ?0. 042b
0.869 ?.047b
0.684 ?.046b
0. 908 ?0. 042b
大豆肽高剂量
600
0.552?.032bd
0.601?.030bd
0.551?.050bc
0.736 ?.058bc
f值
178. 316
115.681
78. 753
123. 500
p值
0. 000
0. 000
0. 000
0. 000
注：与正常对照组比较,p <0.05, bp <0.01;与哮喘模型组比较,p <0.05, dp <0.01
3讨论
支气管哮喘是多种炎性细胞浸润或炎症介质参 与的以气道高反应性及重塑为特点，伴有气管痉挛、 呼吸困难、咳嗽及喘息等症状的呼吸系统炎症性疾 病&]。在本研究中，与正常对照组比较，哮喘模型组 大鼠balf中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞 计数明显增多，且he病理切片观察到气管壁增厚， 管腔变窄，可见多量散在炎性细胞浸润，以上结果与 哮喘的炎症变化及病理学改变相一致，表明ova致 哮喘大鼠模型成功建立。同时，与哮喘模型组比较,大豆肽600、00 mg/kg可减少哮喘大鼠balf中中性 粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数，且肺组织病理 学损伤得到明显改善，提示大豆肽可减轻哮喘大鼠气 道炎症，改善肺组织病理性损伤，对哮喘有一定的防 治作用，但大豆肽防治哮喘的具体机制尚不明确。研 究表明，炎症是导致哮喘患者或哮喘动物模型气道增 殖、气管重塑及肺组织损伤等病理变化的重要因素， 控制炎症反应是缓解哮喘症状的重要措施8 ,为此本 研究以 notch 1/jagged 1/hes 1/nf - kb 这_炎症信 号通路为研究靶点，探讨大豆肽抗炎平喘分子机制。
哮喘的发生发展与炎症细胞释放炎性介质（如
il-lp、il-6及tnf-a等）激活notch 1信号通路 密切相关9 — 10]。notch 1信号通路由其相应的配体 (jagged 1)、受体（notch 1)及上下游信号效应分子 (hes 1、nf - kb)等组成，其调节异常可介导哮喘炎 症的发生，参与气道增殖、气管重塑等病理过程[11]。 在炎症刺激作用下，jagged 1与notch 1相互结合， notch 1 路即被激活，高表达 notch
(notch intracellular domain, nicd)被释放，其下游 hes 1等关键靶基因被启动，从而上调气道上皮胶原蛋白 的表达，诱发气道上皮下增殖和纤维化，引起哮喘气 道重塑等病理性损伤[12-13]。nf - kb是notch 1信号 通路调控巨噬细胞介导的炎症反应主要靶分子之一， notch 1通路活化后，激活i - kb激酶（i - kb kinase, ikk), ikk作用于i - kb使其发生磷酸化，使得nf - kb/ i - kb二聚体复合物解离,nf - kb发生磷酸化 并通过核膜转移进入核内，与dna特异性结合位点 相互作用，快速启动il - 6、il - 5及tnf - a等靶基 因的转录,生成相应的炎症因子，促使炎症反应的发 生[14]。同时,生成的炎症因子又是notch 1和nf - kb 的活化剂，进一步激活 notch 1/jagged 1/hes 1/nf -kb信号通路，如此周而复始使炎症反应持续放大 和扩散，使哮喘症状不断加重，诱发气道内皮细胞增 殖和气管重塑等病理性损伤[15]。本研究发现，大豆 肽600 mg/kg可使哮喘大鼠肺组织notch 1、jagged 1、 hes 1及nf - kb mrna和蛋白表达水平明显下降， 提示其抗炎平喘机制与下调notch 1/jagged 1/hes 1/ nf-kb信号通路有关。
